| Abstract | Uvod: Zloćudna novotvorina jajnika ili karcinom jajnika je sedmi po redu karcinom u žena,
čineći 3% svih maligniteta i 6% svih smrtnosti od karcinoma u žena. Uzrok nastanka
karcinoma jajnika, još uvijek, nije razjašnjen. Postoji nekoliko čimbenika koji su povezani s
povećanom ili smanjenom opasnošću od nastanka zloćudnog tumora (rađanje, dojenje,
neplodnost, oralna kontracepcija, hormonsko nadomjesno liječenje, K-ras i HER-2/neu
onkogeni, BRCA1 i BRCA2 te p53 tumor supresor geni). Prema najnovijim procjenama
signalni put Hh-Gli sudjeluje u jednoj trećini svih smrtonosnih tumora, pa prema tome postaje
vrlo značajnom metom potencijalnih terapija raka. Malo se zna o ulozi signalnog puta Hh-Gli
u nastanku karcinoma jajnika i o interakciji tog puta s genima BRCA1 i BRCA2. U ovom
istraživanju željeli smo ispitati značaj signalnog puta Hh-Gli na zloćudnim epitelnim
tumorima jajnika, posebice u komunikaciji između strome i epitela. ----- Materijali i metode: U periodu od 2007. do
2010. godine prikupljeno je 13 karcinoma
jajnika, 7 “borderline” tumora jajnika i 3 fibroma jajnika. Metode koje smo koristili u ovom
istraživanju su: ekstrakcija RNA iz tkiva i stanica, ekstrakcija DNA iz tkiva i krvi, mjerenje
koncentracije DNA, provjera kvalitete i koncentracije RNA, reverzna transkripcija,
kvantitativni real-time PCR, statistička obrada podataka, analiza mutacija gena BRCA1 i
BRCA2 (fragmentalna analiza i određivanje slijeda nukleotida (sekvenciranje)), analiza
gubitka heterozigotnosti, uzgoj i održavanje stanica u kulturi, MTT test, transfekcija,
migracija i RNA utišavanje. ----- Rezultati: Rezultati koje smo dobili jasno ukazuju na pojačanu aktivnost gena
signalnog puta
Hh-Gli, BRCA1, BRCA2 i survivina i u karcinomima jajnika i u „borderline“ tumorima
jajnika. Tumori jajnika pokazuju povećanu ekspresiju svih gena signalnog puta Hh-Gli:
PTCH1, SMO, GLI1, SHH, SUFU, kao i gena vezanih uz preživljenje stanica (SURVIVIN) te
gena uključenih u popravak oštećenja DNA (BRCA1, BRCA2). Također smo utvrdili da se
ekspresija PTCH1, SHH i BRCA2 mijenja ovisno o tipu tumora i stadiju bolesti. Značajno je
zapažanje da je ekspresija PTCH1 viša u nižim FIGO stadijima karcinoma nego u višima, dok
je još niža u „borderline“ tumorima i na kraju najniža u fibromima. Naprotiv, ekspresija SHH
je obrnuta, s najnižom ekspresijom u karcinomima FIGO stadija I, nešto višom u
karcinomima FIGO stadija II i III, još višom u „borderline“ tumorima te najvišom u
fibromima. Pokazali smo da je izvrsna korelacija između GLI-SUFU-SMO te BRCA1-
BRCA2 kod svih ispitivanih tumora te slaba povezanost gena PTCH1 s apoptozom putem
survivina dok je umjerena povezanost PTCH1 sa SUFU i SMO, a sa GLI1 slaba ili umjerena.
Značajno je da ligand SHH protein djeluje proliferativno i pojačava migraciju stanica.
Pokazali smo da se signalni put Hh-Gli pokreće ubacivanjem konstrukta Gli1, što uzrokuje
povećanje ekspresije PTCH1, SMO, GLI2 i SUFU, ali ne i GLI3. Važno je otkriće da je
ekspresija gena BRCA1 i BRCA2 povezana sa signalnim putem Hh-Gli, čime se dodatno daje
veliki značaj važnosti povezanosti patologije dojke i jajnika. Pokazali smo da se signalni put
Hh-Gli može blokirati ciklopaminom vec nakon 24 sata, te da utišavanje gena PTCH1 izaziva
povećanje ekspresije gena SUFU mehanizmom kompenzacije, a smanjenje GLI1, BRCA1,
BRCA2 te survivina.
Naša su ispitivanja pokazala da se razina gena SMO uglavnom ne mijenja utišavanjem
PTCH1, što bi značilo da genska ekspresija koreceptora nije regulirana GLI1 transkripcijskim
faktorom, te da utišavanje gena SUFU smanjuje ekspresiju gena GLI1 i PTCH1. ----- Zaključak: Pojačana aktivnost gena
signalnog puta Hh-Gli, BRCA1, BRCA2 i survivina
prisutna je i u karcinomima jajnika i u „borderline“ tumorima jajnika. Utvrdili smo da se
ekspresija PTCH1, SHH i BRCA2 mijenja ovisno o tipu tumora i stadiju bolesti. Pokazali
smo da je izvrsna korelacija između GLI-SUFU-SMO te BRCA1-BRCA2 kod svih
ispitivanih tumora. Signalni put Hh-Gli se pokreće ubacivanjem konstrukta Gli1, što uzrokuje
povećanje ekspresije PTCH1, SMO, GLI2 i SUFU, ali ne i GLI3. Važno je otkriće da je
ekspresija gena BRCA1 i BRCA2 povezana sa signalnim putem Hh-Gli. SHH protein djeluje
proliferativno i pojačava migraciju stanica. Signalni put Hh-Gli može se blokirati
ciklopaminom već nakon 24 sata. Utišavanje gena PTCH1 izaziva povećanje ekspresije gena
SUFU mehanizmom kompenzacije, a smanjenje GLI1, BRCA1, BRCA2 te survivina dok
utišavanje gena SUFU smanjuje ekspresiju gena GLI1 i PTCH1. |
| Abstract (english) | Introduction: Ovarian cancer is the seventh most common cancer in women, taking 3% of
malignancies and 6% of mortality of all cancers in women. Etiology of ovarian cancer is still
not ascertained. There are several factors associated with genesis of ovarian cancer (gestation,
lactation, sterility, oral contraception, hormone replacement therapy, K-ras and HER-2/neu
oncogenes, BRCA1 and BRCA2 gene and p53 tumor supresor gene). The Hh-Gli signaling
pathway participate in one third of all lethal tumors and therefore is very important target as
potential cancer therapy. Interaction of the Hh-Gli signaling pathway with BRCA1 and
BRCA2 gene in genesis of ovarian cancer is insufficient and our plan was to explore the
importance of the Hh-Gli signaling pathway in ovarian cancer genesis, especially in
communication between stromal and epithelial tissue. ----- Materials and methods: In period from 2007 till 2010 year there are collected 13 ovarian
cancers, 7 borderline ovarian tumors and 3ovarian fibromas. Methods which we used in our
study were: extraction of RNA and DNA from tissue, cells and blood, measurement of DNA
concentration, verification of RNA quality and concentration, reverse transcription, qRTPCR,
statistical data analysis, mutation analysis of BRCA1 and BRCA2 gene, LOH,
cultivation and preservation of cell culture, MTT test, transfection, migration and RNA
silencing. ----- Results: We found that the enhanced gene expression of the Hh-Gli signaling pathway,
BRCA1 and BRCA2 gene and survivin is present in ovarian cancers and bordeline ovarian
tumors. Ovarian tumors show enhanced expression of all genes: PTCH1, SMO, GLI1, SHH,
SUFU, BRCA1, BRCA2 and survivin. The expression of PTCH1, SHH and BRCA2 genes is
changing in different types of tumors and FIGO stages. The higher expression of PTCH1 gene
is present in lower FIGO stages of ovarian cancers, and lower expression of PTCH1 gene is
present in borderline ovarian tumors and fibromas. The expression of SHH gene is the lowest
in FIGO stages I, II and III of ovarian cancer, higher in borderline ovarian tumors and the
highest in fibromas. Remarkably correlation was found between GLI-SUFU-SMO and
BRCA1-BRCA2 gene, mild between PTCH1-SUFU and PTCH1-SMO and low correlation
between PTCH1-survivin and PTCH1-GLI1. The SHH ligand has a major effect on cell
proliferation and migration. Transfection of GLI1 construct enhance the expression of
PTCH1, SMO, GLI2 and SUFU, but not GLI3. Very important finding is that the expression
of BRCA1 and BRCA2 gene is connected with the Hh-Gli signalig pathway. Cyclopamin,
after 24 hours, can inhibit the Hh-Gli signalig pathway. Silencing of PTCH1 enhance the
expression of SUFU by compensation mechanism, and reduce the expression of GLI1,
BRCA1, BRCA2 gene and survivin. Silencing of PTCH1 does not change the expression of
SMO indicating that the expression of SMO is not regulated by transcription factor GLI1.
Silencing of SUFU reduce the expression of GLI1 and PTCH1. ----- Conclusion: The enhanced gene expression of the Hh-Gli signaling pathway, BRCA1 and
BRCA2 gene and survivin is present in ovarian cancers and bordeline ovarian tumors. The
expression of PTCH1, SHH and BRCA2 genes is changing in different types of tumors and
FIGO stages. Remarkably correlation was found between GLI-SUFU-SMO and BRCA1-
BRCA2 gene in all ovarian tumors. Transfection of GLI1 construct enhance the expression of
PTCH1, SMO, GLI2 and SUFU, but not GLI3. Very important finding is that the expression
of BRCA1 and BRCA2 gene is connected with the Hh-Gli signalig pathway. The SHH ligand
has a major effect on cell proliferation and migration. Cyclopamin, after 24 hours, can inhibit
the Hh-Gli signalig pathway. Silencing of PTCH1 enhance the expression of SUFU by
compensation mechanism, and reduce the expression of GLI1, BRCA1, BRCA2 gene and
survivin. Silencing of SUFU reduce the expression of GLI1 and PTCH1. |
