| Abstract | Uvod: Postoje brojne prepreke u translacijskim istraživanjima i njihovoj sigurnoj i efektivnoj
kliničkoj primjeni, kao što je upotreba animalnih modela koji su skupi, zahtijevaju velik
utrošak vremena i ne mogu predvidjeti točan odgovor u ljudi. Ipak, istraživanja koja testiraju
učinke lijekova i patogenezu brojnih patoloških stanja i bolesti, uključujući i bolesti srca, se
većinom provode na životinjskim modelima i zahtijevaju ocjenu valjanosti na ljudskim
modelima. Priznate alternative su ljudski modeli dobiveni iz banaka ljudskog tkiva, ljudske
embrionalne matične stanice (hESC) i ljudske inducirane pluripotentne matične stanice
(hiPSC). Anesteticima-potaknuto prekondicioniranje (APC) je strategija koja potiče
endogene zaštitne mehanizme u stanicama srca koji mogu povećati preživljenje ovih stanica
tijekom ishemijsko-reperfuzijske ozljede. Doktorska disertacija je osmišljena kako bi se
testiralo mogu li se ljudske pluripotentne matične stanice diferencirati u kardiomiocite koji bi
se koristili kao eksperimentalni model za istraživanje APC-a.
Materijali i metode: Predložena disertacija se bazira na istraživanjima provedenim na dvije
vrste ljudskih pluripotentnih matičnih stanica, i to na hESC linijama i hiPSC linijama.
Prethodno je pokazano da se ove pluripotentne matične stanice mogu diferencirati u derivate
svih triju embrionalnih zametnih listića, uključujući i kardiomiocite. U istraživanju se
koristilo komercijalno dostupne hESC linije, H1 i H9, a eksperimenti su se izveli na Medical
College of Wisconsin-u uz odobrenje lokalnog etičkog povjerenstva. hiPSC linije su dobivene
iz laboratorija dr. S. Duncana. Ove stanice su generirane iz fibroblasta kože prepucija nakon
transdukcije s čimbenicima OCT4, NANOG, SOX2 i LIN28. Pokazano je da ekspresija tih
proteina uzrokuje dediferencijaciju već diferenciranih fibroblasta u pluripotentno stanje.
Laboratorij dr. Duncana je potvrdio sve karakteristike pluriopotentnosti ovih stanica i pokazao
da se mogu efikasno diferencirati u hepatocite. Kardiomiociti su diferencirani iz
pluripotentnih stanica metodom usmjerene diferencijacije. Da bi se eksperimenti provodili
isključivo na kardiomiocitima stanice su se obilježile zelenim flourescentnim proteinom
(EGFP) pod transkripcijskom kontrolom gena za miozinski laki lanac 2v (MLC 2v) koji je
specifičan za srčane stanice. Ovakvo obilježavanje se provelo nakon usmjerene
diferencijacije tako da su stanice bile transducirane lentiviralnim vektorom koji sadrži
MLC2v-EGFP konstrukt. Ovaj konstrukt omogućuje da EGFP (koji se detektira zelenom
fluorescencijom) bude izražen samo u stanicama koje istovremeno imaju i MLC-2v
transkripcijski čimbenik, odnosno u kardiomiocitima. Lentiviralni vektor je dobiven iz
laboratorija dr. F. Parka, Medical College of Wisconsin. Svi eksperimenti u kojima se
koristio ovaj virus su provedeni na Medical College of Wisconsin-u. Kardijalna
diferencijacija se testirala imunocitokemijskom detekcijom sarkomerskog α-aktinina,
kardijalnog troponina T i titina. U disertaciji se testiralo mogu li diferencirani kardiomiociti
odgovarati na APC na isti način kao i zreli kardiomiociti, a dobiveni podatci su se usporedili s
rezultatima prethodnih studija. Ispitalo se nekoliko dobro okarakteriziranih i značajnih
komponenti APC-a. Testiralo se može li APC povećati preživljenje kardiomiocita
diferenciranih iz hESC nakon izlaganja oksidativnom stresu koji je induciran uz pomoć
vodikovog peroksida. Zatim se testiralo ima li inhalacijski anestetik izofluran, koji potiče
APC, utjecaja na proizvodnju slobodnih kisikovih radikala, što je izmjereno u hESCdiferenciranim
kardiomiocitima uz pomoć fluorescentnog indikatora dihidroetidina i
konfokalnog mikroskopa. Važni izvršitelji kardioprotekcije APC-om su također testirani.
Ovo uključuju otvaranje ATP-ovisnih kalijevih kanala u mitohondrijima (mitoKATP) i odgodu
u otvaranju mitohondrijske permeabilizacijsko-tranzicijske pore (mPTP). Otvaranje mPTP-a
je inducirano oksidativnim stresom a detektirano je mjerenjem brze i potpune depolarizacije
mitohondrija konfokalnim mikroskopom uz pomoć fluorescentnog indikatora TMRE.
Kvantitativni PCR se koristio da određivanje izražaja gena koji su značajni u različitim
stadijima kardijalne diferencijacije. Potrošnja kisika u izoliranim nakupinama diferenciranih
kardiomiocita je mjerena uz pomoć Clarkove elektrode, što se koristilo za ispitivanje protoka
elektrona kroz respiratorni lanac i neizravno za procjenu moguće opstrukcije respiratornog
lanca od strane izoflurana.
Rezultati: Usmjerena diferencijacija rezultira je visokim udjelom kardiomiocitima u
dijelovima koji spontano i ritmično kucaju, pri čemu je najviše kardiomiocita detektirano u
H1 hESC liniji (85%). U ostalim linijama taj broj se kretao oko 65%. Kardiomiociti su
izražavali sarkomerične proteine, kardijalni troponin T, sarkomerični α-aktinin i titin. U
hESC-kardiomiocitima su detektirani akcijski potencijali koji morfološki odgovaraju zrelim
ventrikularnim i atrijskim srčanim stanicama. APC u hESC-kardiomiocitima potiče
protektivne mehanizme što se očitovalo poboljšanim preživljenjem nakon izlaganja
oksidativnom stresu te odgođenim otvaranjem mPTP-a. mPTP je ključni događaj koji inicira
različite puteve koji dovode do smrti stanice Pokazano je da izofluran djelomično inhibira
respiratorni lanac u hESC-kardiomiocitima što dovodi do umjerenog porasta u proizvodnji
kisikovih radikala koji igraju ključnu ulogu u unutarstaničnoj signalizaciji tijekom
prekondicioniranja. Izofluran je doveo i do otvaranja mitoKATP kanala, koji je također važan
medijator prekondicioniranja. APC je odgodilo otvaranje mPTP-a i u hiPSC-kardiomiocitima.
Kvantitativni PCR je pokazao da usmjerena diferencijacija dovodi do sličnog obrasca izražaja
različitih gena tijekom diferencijacije hESC i hiPSC linija. Pokazano je da tijekom
diferencijacije prvo dolazi do smanjenog izražaja gena pluripotentnosti (OCT4), nakon čega
slijedi kratkotrajni porast izražaja mezodermalnog markera (brachyury). Rana faza kardijalne
diferencijacije je obilježena izražajem nekoliko gena, MESP1, NKX2.5 i ISL1. Terminalna
faza kardijalne diferencijacija je obilježena izražajem GATA4, MEF2C, TNNT2, TBX20 i
MYL7. Ionski kanali SCN5A, CACNA1C, KCNH2, KCNJ2 i KCND3 su uglavnom bili
izraženi tijekom kasne faze diferencijacije.
Zaključci: Ova disertacija je ponudila nekoliko dokaza koji podupiru hipotezu da se
kardiomiociti diferencirani iz ljudskih pluripotentnih matičnih stanica mogu koristiti za
proučavanje APC-a in vitro. Ovo uključuje: 1) učinkovitu diferencijaciju velikog broja
kardiomiocita, 2) kardiomiogenezu koja rekapitulira vremenski obrazac izražaja ključnih gena
važnih za normalnu srčanu diferencijaciju, 3) diferencijaciju kardiomiocita koji su
ekscitabilne stanice, koji imaju funkcionalne sarkomere, te mogu izvoditi kontrakcije i 4)
kompetentne odgovore na APC uz aktivaciju karakterističnih medijatora prekondicioniranja. |
| Abstract (english) | The lack of human myocardium for research purposes represents a great problem in
studying pathogenesis of human cardiac disease. The doctoral dissertation is designed to test
whether cardiomyocytes differentiated from human pluripotent stem cells can be used for
studying anesthetic preconditioning (APC), a cardioprotective strategy. Human embryonic
stem cell (hESC) lines, H1 and H9, and human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines,
C2a and C6a were differentiated into cardiomyocytes by directed differentiation. All
experiments with hESCs were conducted at the Medical College of Wisconsin using
commercially available lines and their use was approved by the local Ethical Committee.
hiPSC were obtained from the laboratory of Dr. S.A Duncan, MCW. Cardiac differentiation
of hESC and hiPSC lines was accompanied with the occurrence of spontaneous contractions
in cell clusters. Cardiac enrichment was greater than 65% in beating clusters of all cell lines.
Living differentiated cardiomyocytes were labelled with a genetic construct, MLC 2v-EGFP,
delivered by a lentiviral vector. Immunostaining for sarcomeric proteins, sarcomeric-α
actinin and cardiac troponin T revealed that sarcomeres in hESC- and hiPSC-derived
cardiomyocytes exhibited a proper striated pattern. The time course of expression of genes
involved at various stages of cardiomyogenesis was analyzed by qPCR in all hESC and hiPSC
lines. It revealed that the loss of expression of pluripotency and later mesodermal gene was
accompanied by the increase in expression of genes of early phase of cardiac differentiation.
Genes characteristic for terminal cardiac differentiation were expressed during the second
week of cardiomyogenesis. APC of hESC- and hiPSC-derived cardiomyocytes induced a
delay in opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP) in stressed cells,
which is a critical mediator of protection by APC. Increase in the survival of preconditioned
cardiomyocytes correlated with the delay in mPTP opening in hESC-derived cardiomyocytes.
Isoflurane activated characteristic mediators of preconditioning in hESC-derived
cardiomyocytes. It induced opening of mitoKATP channels and moderately increased
production of reactive oxygen species by inhibiting respiratory chain.
In conclusion, functional human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes can be
efficiently differentiated in vitro. These cells exhibit competent responses to APC and
therefore could be used as a reliable experimental models for studying APC. |
