| Abstract | Istraživanje dopaminskog sustava ključno je za razumijevanje normalnog ljudskog ponašanja, kao i mnogih psihijatrijskih i neuroloških bolesti. Međutim, podatci o raspodjeli dopaminskih D2 receptora (DR2) u neuronima prefrontalnog korteksa čovjeka su nepotpuni, a rezultati izražaja DR2 u potpornim (glija) stanicama su oprečni. Nadalje, izraženost i stanična i subcelularna lokalizacija dugog (D2L) i kratkog (D2S) izo-oblika DR2 u moždanom tkivu čovjeka i miša te u staničnim modelima do sada još nisu istražene.
U ovom doktorskom radu imunohistokemijskom i imunofluorescentnom metodom prikazana je slojevna i stanična raspodjela D2 skupine receptora u dorzolateralnoj, orbitomedijalnoj i medijalnoj prefrontalnoj moždanoj kori čovjeka. Dopaminski DR2 i DR4 receptori su bili značajno jače izraženi u odnosu na DR3 u svim regijama. Što se tiče slojevne raspodjele, DR2 i DR4 su pokazali bilaminarnu raspodjelu i bili posebno izraženi u piramidnim slojevima korteksa. Pritom su DR2 bili nešto izraženiji u III, a DR4 u V-VI kortikalnom sloju. Na staničnoj razini, DR2 su bili pretežno izraženi na piramidnim neuronima, a značajno manje interneuronima. Od glija stanica, astrociti prvog sloja i subkortikalne bijele tvari su pokazali značajnu DR2-imunoreaktivnost. Nasuprot uobičajenom mišljenju da su neurotransmitorski receptori pretežno izraženi na staničnoj membrani, ovdje se pokazalo da se DR2 u velikoj mjeri nalaze u citoplazmatskim vezikulama. Navedeni je nalaz potvrđen i proširen pokusima na primarnim kulturama kortikalnih neurona miša i staničnim kulturama SY5Y i NT2. Nadalje, transfekcijom primarnih neuronskih kultura genskim konstruktom za fluorescentno obilježene D2L i D2S pokazalo se da je kretanje navedenih receptora vrlo dinamičan proces.
Osim toga, razina mRNA za D2L i D2S kvantitativno je istražena metodom mikropostroja u dorzolateralnoj i orbitomedijalnoj regiji korteksa čovjeka. Tom metodom razina mRNA za navedene receptore nije bila mjerljiva. Pokusi provedeni na uzorcima mišjeg mozga pomoću qRT-PCR pokazali su da je u svim analiziranim regijama (korteks, strijatum, talamus, hipokampus, moždano deblo) D2L jače izražen u odnosu na D2S. Međutim, D2S je u moždanom deblu i talamusu relativno jače izražen u odnosu na ostale regije, što ukazuje na njegovu presinaptičku funkciju. Zaključno, ovi rezultati ukazuju na aktivnu ulogu astrocita
62
koji izražavaju receptore za DR u PFC. Shodno tome, može se zaključiti da izraženost DR ne samo na neuronima, nego i na glija stanicama može imati kliničke implikacije s obzirom na djelovanje PFC i njegove poremećaje u shizofreniji, bolestima ovisnosti, depresiji i drugim psihopatološkim stanjima. |
| Abstract (english) | The brain dopamine systems are of key importance for understanding human behavior as well as various psychiatric and neurological disorders. The existing studies showed inconclusive evidence for the expression of D2 dopaminergic receptors (DR2) using specific monoclonal antibodies in the human prefrontal cortex. Additionally, there have been contradictory reports in relation to the expression pattern of D2R in glial cells and subcellular localization of the long (D2L) and short (D2S) mRNA isoforms of DR2 have not been elucidated in the human brain.
In this study we investigated the layer- and cell-specific localization and distribution of DR2 in the dorsolateral, orbitomedial and medial prefrontal human cortex. Dopamine DR2 and DR4 receptors had stronger expression than DR3 in all regions. DR2 and DR4 showed a bilaminar distribution pattern and were particularly expressed in the pyramidal cortical layers III and V. However, DR2 had stronger expression in layer III, whereas DR4 in layer V-VI. At the cellular level, DR2 were predominantly expressed in pyramidal neurons, although some interneurons also showed DR2-immunopositivity. Suprisingly, astrocytes localized in layer I and subcortical white matter showed significant DR2 expression. Contrary to previous findings, which localize DR2 to the cell membrane, we found a more distinct vesicular localization in the cytoplasm. This finding was repeadly confirmed through experiments on mouse primary cortical cultures, as well as SY5Y and NT2 cell cultures. Moreover, transfection of D2L and D2S into primary neuronal cultures showed a dynamic trafficking of these receptors.
The mRNA expression of the long and short isoform of DR2 in the human dorsolateral and orbitomedial prefrontal cortex was assessed by using microarray chips. Although the expression of mRNA for both isoforms was not detectable, we analyzed various mouse brain regions (cortex, striatum, thalamus, hippocampus, brain stem) with qRT-PCR and showed that D2L had a stronger expression than D2S in all brain regions. However, D2S had a relatively stronger expression in brain stem and thalamus, indicating its presynaptic function. In conclusion, these results suggest an active role of astrocytes expressing dopaminergic receptors in the human PFC. Consequently, alterations of not only neuronal, but also glial DR
expression may have clinical implications with respect to function of PFC and its disturbances in schizophrenia, drug abuse, depression and other psychopathological states. |
